Analyse conectomique unicellulaire des poumons de mammifères adultes

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décembre 4, 2019 Non Par Camille Leroy


INTRODUCTION

Il est connu que la signalisation des cellules par des signaux solubles et insolubles est cruciale pour la régulation des niches cellulaires et l’apparition de propriétés tissulaires (1, 2) Cependant, les signaux qui régissent l'homéostasie des tissus sont difficiles à capter in vivo en raison de leur grande complexité et de leur sensibilité à l'environnement extracellulaire (35 5) Les progrès récents dans le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq) ont permis une analyse sans précédent de la rétine, de l’hypothalamus, du cortex, de l’intestin, du sang, du cœur, des poumons et d’autres organes (6 618 années) Un plan international ambitieux est en cours d'élaboration pour consolider les données unicellulaires de chaque tissu du corps humain (19, 20) Cependant, à ce jour, peu d’analyses entre espèces ont été réalisées pour identifier des schémas de signalisation qui pourraient fondamentalement régir le développement des tissus et l’homéostasie. La structure et la fonction du tissu pulmonaire chez les mammifères sont hautement conservées, avec des tailles d’alvéoles stéréotypées, des distances de diffusion air-sang et des géométries de ramification des voies respiratoires (21) Pour déterminer si des schémas de communication stéréotypés cellule-cellule accompagnent ces aspects préservés de la structure et de la fonction pulmonaires, nous générons et analysons des données scRNAseq à partir de tissus pulmonaires chez quatre espèces de mammifères (souris, rat, porc et humain). En cartographiant nos données avec la base de données FANTOM5 sur les interactions protéine-protéine de mammifère, nous capturons une interaction complexe de facteurs moléculaires qui contribuent à l'organisation et au fonctionnement du poumon distal (14, 22) Grâce aux comparaisons d’espèces, nous avons pu quantifier les modèles de signalisation homéostatique conservés et non conservés dans le tissu pulmonaire de mammifères adultes. En tirant parti des outils de connectivité basés sur la théorie des graphes, nous démontrons une conservation évolutive substantielle dans les topologies de réseau de signalisation de cellule à cellule. En outre, nous synthétisons les résultats inter-espèces pour illustrer des niches de types de cellules spécifiques et identifier les rôles de signalisation clés pour des types de cellules spécifiques. La carte obtenue présente un portrait de l'alvéole au niveau des systèmes basés sur les données. Les découvertes spécifiques pouvant être explorées avec cette carte incluent les interactions extensives mésenchymateuses-épithéliales, l'implication des macrophages et de la matrice, ainsi que les fondements mécanistes de l'influence des cellules alvéolaires de type I (ATI) sur l'endothélium microvasculaire et l'homéostasie parenchymateuse.

Résultats

Le profil pulmonaire unicellulaire crée un atlas pulmonaire inter-espèces

Pour obtenir des données unicellulaires à partir de tissus pulmonaires adultes sains, nous isolons les poumons de souris, de rats, de porcs et de donneurs humains et les dissocions à l'aide de digestions enzymatiques courantes (voir Matériels et méthodes). Les échantillons ont été séquencés en utilisant la génomique 10x dans une proportion de 1 individu: 1 lot pour permettre la déconvolution de tout individu aberrant. Vous trouverez un résumé complet de tous les lots dans le tableau S1. L'ensemble de données final qui passe avec succès le contrôle de qualité (Fig. 1 et Fig. S1) contenait 17 867 cellules humaines saines (14 individus, sexe mixte, âgés de 21 à 88 ans), 11 452 cellules de porc (2 individus, mâles / mâles) Âgés de 3,5 mois), 10 953 cellules de rat (2 individus, mâle / femelle, âgés de 9 semaines) et 7744 cellules de souris (2 individus, mâle / femelle, âgés de 9 semaines). Les cellules avaient une profondeur de lecture moyenne d'environ 88 000 lectures par cellule. La fraction mitochondriale moyenne dans l'ensemble des données était de 2,09%, ce qui indique une excellente conservation de la transcription. La distribution spécifique du lot pour la numération de la transcription, la numération des gènes et la fraction de lecture mitochondriale peut être trouvée sur la fig. S2 (A à C). Chaque espèce a été regroupée indépendamment en utilisant une analyse de corrélation canonique (CCA), mise en œuvre à Seurat, pour aligner les lots (fig. S1). Le regroupement de Seurat a résolu environ deux douzaines de groupes bien définis de chaque espèce de mammifère, avec une distribution de types de cellules variables par espèce (Fig. 1B et Fig. S2D). La figure 2 montre un atlas de marqueur limité pour tous les types de cellules, permettant une comparaison rapide entre les espèces. La figure S3 montre un atlas de marqueur plus profond, entre espèces, organisé par classe de cellules. Diverses populations épithéliales, y compris les cellules ATI et ATII, et l'épithélium ciliée, sécrétoire et basal ont été capturées. Nous avons identifié quatre populations stromales principales conservées entre les espèces, à savoir Col13a1+ fibroblastes, Col14a1+ fibroblastes et cellules musculaires lisses (SMC) (ailleurs appelés lipofibroblastes, fibroblastes interstitiels et myofibroblastes) (18 années, 23), ainsi que les cellules stromales mésothéliales. Comme la séparation des types de cellules dans le mésenchyme pulmonaire est difficile, les fibroblastes, les péricytes et les CML ont été subdivisés de chaque espèce, puis isolés pour permettre de mieux explorer le regroupement inter-espèces et le marquage analogue ( voir figure S4). Comme il existe un caractère commun important entre les deux populations de fibroblastes à la fois en scRNAseq et en histologie, nous n’avons pas pu identifier les sites définitivement ségrégés pour chaque population sur la base de l’histologie. Cette tâche est fondamentalement compliquée compte tenu de la pénurie de marqueurs de groupement positifs et spécifiques pour Col14a1.+ Ville.

Figure 1 Ensemble de données de scRNAseq pulmonaire entre les espèces.

(ONGLE) Les poumons de souris, de rats, de porcs et de donneurs humains ont été dissociés, codés avec un code-barres en utilisant la génomique 10x et séquencés dans des séquenceurs Illumina. Les cellules ont été regroupées après alignement du génome et réduction de la dimensionnalité. Les marqueurs ont été identifiés par expression différentielle et corrélés à la littérature et à l’Atlas des protéines humaines (24) et immunomarquage interne. L'analyse comparative ligand-récepteur révèle des rôles cellulaires stéréotypés dans l'homéostasie des tissus. (oui) Une communauté hétérogène comparable de cellules a été profilée chez les quatre espèces. Les types de cellules conservés dans les espèces comprennent l'épithélium de type I, de type II, cilié et sécrétoire; endothélium capillaire, vasculaire et lymphatique; Les cellules B, les cellules T et les cellules tueuses naturelles (NK); SMC; Col13+ et Col14+ les fibroblastes; et deux sous-ensembles distincts de macrophages.

Figure 2 Représentation de l'atlas cellulaire entre espèces.

(ONGLE) Le DotPlot divisé par espèce montre une comparaison entre les espèces de marqueurs supérieurs sélectionnées pour toutes les populations de cellules profilées de toutes les espèces. La saturation des couleurs indique la force d'expression dans les cellules positives, tandis que la taille du point reflète le pourcentage de chaque groupe de cellules qui exprime le gène. Chaque couleur représente une espèce. Certains types de cellules ne sont décrits que chez certaines espèces, telles que les cellules basales marquées par KRT5 (porc et humain) et Sox9.+ épithélium (rat). ITGA8 / Itga8 marque de manière fiable le Col13a1+ population de fibroblastes à travers les espèces. Histologie de marqueurs spécifiques hautement exprimés de types de cellules conservés, tirée de l’Atlas des protéines humaines (images immunopéroxydases (re)) et immunocoloration interne (images immunofluorescentes (oui et faire)), montre des emplacements physiques positifs de marqueurs de types de cellules spécifiques identifiés. Les marqueurs indiqués sont ceux qui étaient présents dans l'ensemble de données humaines et qui ont des équivalents dans une espèce non humaine. Barres d'échelle, 50 um (D) et 62 um (B et C).

Sur la base des données histologiques de l’atlas des protéines humaines (24) et immunomarquage interne chez la souris, le rat et l’homme (les exemples choisis sont illustrés à la Fig. 2, B à D), nous identifions deux catégories très différentes d’endothélium sanguin dans les poumons, que nous avons attribuées en fonction de la localisation histologique, comme l’endothélium. Échange gazeux capillaire et endothélium vasculaire mixte, avec une certaine représentation dans la région microvasculaire. De plus, il existe un groupe d'endothélium lymphatique (Fig. 1B). En outre, nous décrivons une grande variété de cellules immunitaires résidant dans les poumons, notamment les cellules B, les cellules T, les cellules tueuses naturelles, les monocytes, les cellules dendritiques, les neutrophiles et de multiples populations de macrophages. Pour comparer quantitativement les groupes de cellules entre les espèces et assurer un marquage similaire, nous convertissons les noms de gènes non humains en homologues humains si possible (voir Matériels et méthodes). Les indices de Jaccard ont ensuite été calculés pour chaque groupe de comparaison chez toutes les espèces. La figure 1 montre une représentation du marquage analogue des types de cellules parmi les espèces. S5 Ces résultats et attributions d’identité de cellule s’alignent bien avec la littérature récente de scRNAseq (18 années, 23)

Connectomie comparative ligand-récepteur identifie les modèles de signalisation extracellulaires conservés

Pour explorer la similarité entre les espèces dans les topologies de signalisation globales, nous cartographions tous les vecteurs de signalisation ligand-récepteur possibles dans chaque espèce, puis nous les comparons. Après identification du groupe de cellules, l’expression moyenne dans les groupes a été calculée pour tous les ligands et récepteurs de la surface des cellules connus et supportés présents dans la base de données FANTOM5 (Fig. 3A) (Fig. 3A) (Fig. 3A).25) Lorsque deux groupes de cellules exprimaient une paire ligand-récepteur apparentée dans plus de 5% des cellules, une bordure était créée qui reliait les deux groupes. Le poids du bord pour l'analyse du réseau a été calculé comme étant la somme des deux valeurs d'expression mises à l'échelle (voir le texte complémentaire pour le raisonnement). Les molécules de signalisation considérées étaient les facteurs de croissance, les cytokines, les protéines chimiotactiques, les hormones, les protéines de la matrice sécrétées et les molécules d’adhésion cellule-cellule. Chaque paire ligand-récepteur a été classée manuellement dans l'une des 38 familles de signalisation sur la base de la littérature établie (voir fichier de données S1). Certains de ces ligands étaient exprimés dans le pain dans la plupart des types de cellules à de faibles concentrations, telles que ICAM-1. D'autres, comme le VEGFA, ont augmenté de façon marquée dans certains groupes de cellules, suggérant des producteurs ou des récepteurs biologiquement pertinents (Fig. 3, B et C). La cartographie résultante a créé un réseau pondéré, dirigé et multiplexé qui décrit les interactions possibles entre cellules au sein du poumon adulte, récompensant quantitativement les producteurs périphériques et les récepteurs pour chaque mécanisme de signalisation (Fig. 3D).

Fig. 3 La comparaison du réseau mondial révèle des schémas de signalisation conservés sous-tendant l'homéostasie pulmonaire chez l'adulte.

(ONGLE) Schéma de traitement de données. L'expression des gènes a été moyennée par cluster et cartographiée par rapport à la base de données FANTOM5 ligand-récepteur. Lorsque deux nœuds ont exprimé une paire ligand-récepteur apparentée, une bordure pondérée a été créée (voir Texte complémentaire). (oui) L’expression promiscueuse entre types de cellules (ICAM1) entraîne une faible distribution des poids de bordure. (faire) L’expression de type de cellule spécifique (VEGFA) entraîne une distribution plus élevée du poids dans les bordures (flèches noires). (re) Connectome global chez les quatre espèces, qui montre la somme des poids de bordure entre les nœuds conservés. La taille du sommet (noeud de cellule de couleur) est proportionnelle au score de Kleinberg, tandis que l'épaisseur des arêtes est proportionnelle à la somme des poids entre deux noeuds. Les similitudes dans la structure de signalisation générale entre les noeuds de cellules sont facilement observables. (mon) Comparaison de la classification et de l’effet de seuil. Les cellules stromales ont les grades les plus élevés, tandis que les cellules lymphoïdes ont les grades les plus bas. le X axe ("percent_exp") est le pourcentage de la grappe qui exprime le marqueur, et le et axe est le degré de chaque nœud tracé sur une échelle logarithmique. (F) Corrélations quantitatives entre espèces. Graphes des coefficients de corrélation de Spearman ("ρ"), avec l'homme comme référence, des classifications des métriques de centralité nodale sur des seuils croissants de la fraction de cellules dans un noeud qui exprime le ligand et le récepteur. Notez que les coefficients de corrélation sont relativement élevés (> 0,75) et restent donc jusqu’à environ 40% d’expression, ce qui signifie que 40% des cellules du noeud expriment le ligand ou le récepteur. Cela montre que les relations nœud-nœud sont robustes au seuil. Ceci suggère un degré élevé de conservation évolutive dans la structure de la connectomie pulmonaire, car les quatre espèces sont hautement corrélées.

Pour comparer quantitativement les réseaux de signalisation des quatre espèces, nous calculons les métriques de centralité du réseau pour la collection limitée de cellules présentes dans toutes les espèces. Les classifications de centralité ont été créées sur la base de la somme de tous les poids des arêtes. Les scores de hub et d’autorité de Kleinberg (indicateur de l’influence de la communauté (hub) et de la réception (autorité)) et les classifications générales des niveaux de réseau (indicateur de connectivité bidirectionnelle) étaient hautement conservés parmi les espèces. Les cellules mésenchymateuses présentent généralement le plus haut niveau de connectivité avec les autres types de cellules des quatre espèces (Fig. 3D), en grande partie en raison de leur forte production de protéines matrices pouvant interagir avec les intégrines de nombreux types de cellules. En revanche, les cellules lymphoïdes (B et T) présentaient généralement le niveau de connectivité le plus faible, ce qui était surprenant compte tenu de leur caractère immunitaire, mais conforme à leur présence transitoire dans le tissu parenchymal. De manière inattendue, les cellules ATI ont toujours été identifiées comme un centre de signalisation important à un niveau proche de celui des cellules mésenchymateuses. Les études initiales ont révélé que cette grande centralité des cellules ATI était étayée par l’expression de gènes clés du facteur de croissance, notamment BDNF, SEMA3E, VEGFA et PDGFA, ainsi que de multiples gènes de ligand WNT (les tracés de violon démontrant ces modèles). conservés en espèces sont illustrés à la figure S6). L’expression de ces divers facteurs de croissance suggère que les cellules ATI, en plus de leur rôle dans l’échange de gaz, pourraient jouer un rôle précédemment sous-estimé dans la régulation d’autres types de cellules du poumon distal en raison de leur capacité à produire des signaux solubles dans les conditions normales. des alvéoles de mammifères adultes.

Pour quantifier directement la conservation de la classification de la signalisation nodale chez les quatre espèces étudiées, nous calculons le degré de nœud et les coefficients de corrélation de Spearman pour la classification de nœud pour les classifications de centralité cellulaire multiple (en utilisant l'ensemble de données humaines). référence) sur l’augmentation des seuils d’expression (Fig. 3, E et F). Dans ce test, une valeur ρ de -1 correspondait à une corrélation inverse, 0 correspondait à une absence totale de corrélation et 1, à une corrélation parfaite. Il a été constaté que les classifications relatives de la centralité du réseau cellulaire spécifique sont fortement corrélées avec les humains entre espèces (ρ> 0,75), ce qui démontre des modèles de topologie de signalisation conservés par espèce. De plus, cette constatation a été maintenue malgré des limites de plus en plus strictes en termes de niveaux d'expression (Fig. 3F), ce qui démontre que la conservation des espèces dans l'architecture de signalisation globale n'est pas une découverte fausse en raison d'un seuil de données arbitraire. Ces résultats suggèrent collectivement que, bien que les cellules de différentes espèces ne soient pas identiques sur le plan transcriptionnel, les schémas de signalisation et de connectivité au niveau du système étaient encore fortement conservés dans les poumons de mammifères adultes.

Les réseaux spécifiques de la cellule destinataire illustrent le caractère de niche

Pour explorer les niches de cellules alvéolaires, l'analyse supplémentaire s'est concentrée sur les interactions conservées entre espèces entre types de cellules alvéolaires physiquement proches (Fig. 4A). La prise en compte de la proximité histologique est essentielle dans les études de communication cellule à cellule, car de nombreuses molécules de signalisation, telles que les effrines et les WNT, nécessitent des distances courtes pour une transduction de signal réussie (2628) Aux fins de la présente analyse et de toutes les analyses ultérieures, les frontières conservées par espèce ont été définies comme celles trouvées chez l’homme et au moins chez d’autres espèces, avec une gamme d’interactions cellule à cellule entre espèces. PAYS valeur (voir Matériels et Méthodes) de <0,05. Les poids des arêtes ont été moyennés parmi les espèces pour obtenir des poids moyens. Cette liste de contrôle des modalités de signalisation conservées par les espèces peut être explorée de manière interactive dans notre ressource en ligne (lungconnectome.net).

Fig. 4 Visualisation des caractères de niche de la signalisation préservée par espèce.

(ONGLE) Classes de cellules à proximité physique proche dans le poumon alvéolaire. L'analyse en aval a été limitée à neuf types de cellules enregistrées spatialement dans la paroi septale alvéolaire. Toutes les paires ligand-récepteur cartographiées ont été classées dans l'une des 38 familles de signalisation (voir légende). Voici des illustrations de schémas de ruche de personnages de niche pour (oui) les macrophages alvéolaires et (faire) endothélium capillaire (voir fig. S7 pour toutes les autres visualisations de niche). Les macrophages alvéolaires présentent une connectivité élevée et expriment clairement des niveaux élevés de molécules d'adhésion cellule-cellule (*). L'endothélium capillaire, en revanche, exprime de nombreux récepteurs pour la signalisation de la famille du VEGF (**).

La figure 4 (B et C) montre deux représentations de la ruche du caractère de niche de cellule. L'ensemble des niches alvéolaires est illustré à la fig. S7 Ces graphiques permettent de visualiser la contribution relative de chaque groupe de cellules et, à partir de ces groupes, de chaque famille de signalisation à la niche pour un type de cellule particulier. Les macrophages alvéolaires (Fig. 4B) expriment plusieurs récepteurs d'adhésion cellule-cellule et, en tant que tels, sont capables d'interagir avec une grande variété de cellules. Les endothéliums capillaires (Fig. 4C), d’autre part, expriment fortement des récepteurs tels que KDR, FLT1 et NRP1, et leur diagramme de niche montre donc une contribution importante de la signalisation de la famille VEGF. Les examens préliminaires des niches ont révélé une interrelation importante entre le mésenchyme et l'épithélium et une production élevée de facteurs de croissance vasculaires et morphogènes par les cellules ATI.

La cartographie du réseau et les résultats au niveau génétique appuient les rôles stéréotypés des cellules

Une ressource en ligne a été créée pour permettre une exploration interactive de la topologie de signalisation dans la famille de signalisation (lungconnectome.net). Cet outil permet d’identifier facilement les schémas biologiquement pertinents, dont nous discuterons certains ici. Les cellules ATII montrent une forte interaction croisée des macrophages basée sur CSF2, complément, GAS6, OSM et APOE, s'alignant sur les rôles connus de l'interaction croisée des macrophages ATII dans la gestion des surfactants et la régulation immunitaire (2931) Sonic Hedgehog (SHH), connu pour son rôle crucial dans le guidage épithélial des cellules mésenchymateuses au cours de la morphogenèse de ramification (3234), ressort de la série de données inter-espèces comme liant exclusivement les populations épithéliales et les cellules mésenchymateuses. Notch ligand DLL4, un important régulateur du développement vasculaire (35), est fortement produite par les cellules endothéliales chez l’adulte et peut être détectée par diverses cellules, notamment les CML et les fibroblastes. Les éphrines, protéines guides spatiales connues pour leur rôle dans la conception des tissus (36), sont fortement exprimés par les populations endothéliales et semblent être perçus préférentiellement par …

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